双探针滚环扩增技术用于产毒藻类的检测

发布时间：2025-05-13 00:35

　　人类活动使海洋环境中的营养物质不断增多,造成海洋微藻大量繁殖,形成有害藻类水华（Harmful Algae Blooms,HABs）。引发HABs的有害藻种使发生水域的生态系统遭到破坏,严重影响沿海地区的经济发展,并且危害人类健康。因此,建立高效、准确的产毒藻种的检测方法在减少HABs的危害中起到重要的作用。本文建立了一种新型等温扩增技术——双探针滚环扩增技术（Double Probe Rolling Circle Amplification,dpRCA）,即将原有滚环扩增的一条锁式探针改为两部分,以提高反应的特异性,并将该技术与横向流动试纸条（Lateral Flow Dipstick,LFD）结合,探讨其在海洋产毒藻类检测中的应用。分别以三种常见产毒微藻(海洋卡盾藻（Chattonella marina）、微小原甲藻（Prorocentrum minimum）以及强壮前沟藻（Amphidinium carterae）)的转录内间隔区（Internal Transcribed Spacers,ITS）作为目标序列,对目标序列进行PCR扩增、克隆和测序,获得它们的完整序列信息。对测序结果...

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-1 dpRCA探针设计原理图及探针与模板结合方式示意图

双探针滚环扩增技术(DoubleProbeRollingCircleAmplification,dpRCA)是为了提高特异性在RCA的基础上发展而来的一种新型等温扩增技术。与传统的RCA只需一条锁式探针不同,dpRCA主要依赖一条短探针(约18nt)和一条长探针(约58....

图3-1目标藻种基因组DNA琼脂糖凝胶(1.0%)电泳图

采用试剂盒法分别提取三种目标微藻的基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳结果如图3-1。可见,基因组DNA的电泳条带均大于2000bp且较为清晰,可用作下一步实验的模板。目标藻中基因组DNA的浓度测定结果见表3-1。

图3-2目标藻种ITS序列的PCR产物琼脂糖凝胶(1.5%)电泳图

采用通用引物对目标藻种的ITS序列进行PCR扩增,结果如图3-2所示。从图中可以看出,三种藻的基因组DNA均能成功扩增出长度在500bp–700bp的单一清晰条带,可进行下一步实验。3.2.3目标藻阳性克隆菌株的筛选

图3-3三种目标藻种克隆菌株菌落PCR产物琼脂糖凝胶(1.5%)电泳图片注:M,DL 1000 marker;泳道1-3:海洋卡盾藻,微小原甲藻,强壮前沟藻

对目标藻种ITS序列PCR产物进行切胶回收,回收产物与pMDTM18-T载体连接制备重组质粒并转化感受态大肠杆菌细胞,通过菌落PCR对克隆结果进行验证。菌落PCR结果如图3-3,片段长度与之前的PCR扩增结果一致,可用于测序。3.2.4目标序列的测序及比对结果

本文编号：4045468