叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR测定布鲁氏菌活菌数方法的建立

发布时间：2025-05-01 09:06

　　 为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PCR方法(PMA-qPCR),并评估了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,建立的qPCR标准曲线Ct值与质粒标准品拷贝数对数值之间线性关系良好;特异性试验结果显示,该方法对布鲁氏菌S2株扩增结果为阳性,对大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌扩增结果均为阴性;其对布鲁氏菌S2的检测限为10～3cfu/mL,比常规PCR方法敏感性高100倍;重复性试验结果显示,批间及批内重复试验的变异系数均为0.63%～2.04%,重复性好。利用该方法对不同比例布鲁氏菌S2活菌/死菌混合样品定量测定,结果显示随活菌比例的增大,测得的活菌数与常规qPCR测定值越接近,表明经优化处理的PMA有效抑制了qPCR对死菌DNA的扩增,但对活菌的qPCR扩增无影响。将该方法与平板计数法共同测定TSB纯培养的布鲁氏菌S2活菌数,结果二者的测定值无统计学差异。随后利用这两种...

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【部分图文】：

图1 qPCR的标准曲线

对PMA的最佳曝光时间、最适浓度进行优化。不同曝光时间结果显示，随着曝光时间的延长，Ct值不断增大，当曝光时间≥10min时各个曝光时间点的Ct值均无显著差异（p>0.05）（图2A）；不同浓度PMA对热致死菌作用的结果显示，随着PMA浓度的增大，扩增的Ct值不断增大，但当浓度....

图2 PMA处理条件的优化结果

图1qPCR的标准曲线2.4特异性试验结果

图3 PMA-qPCR的特异性试验结果

以提取PMA处理过的大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌、S2菌株的基因组为模板，以质粒标准品为阳性对照，无RNase水为阴性对照，利用本研究建立的PMA-qPCR方法进行扩增。结果显示，除了S2菌株与质粒标准品有特异性扩增外，其余菌株及无RNase水均呈无扩增（图3....

图4 PMA-qPCR的敏感性试验结果

提取PMA处理过的S2菌株基因组，10倍倍比稀释后作为模板，采用PMA-qP-CR扩增。结果显示，当菌液浓度在2.0×103cfu/mL～2.0×108cfu/mL范围内，布鲁氏菌S2经PMA处理（PMA-qPCR方法检测）和未经处理（常规qPCR检测）的扩增曲线基本吻合（图3A....

本文编号：4042017