miR-23a和miR-27b对C 2 C 12 细胞线粒体拷贝数和肌纤维组成类型的影响
发布时间：2025-05-07 22:32
miRNAs是一类长约22nt的非编码小RNA,可与靶基因3'-UTR区结合形成二聚体从而抑制靶基因的翻译或者直接降解靶mRNA,实现调控靶基因的表达的生物学功能。研究发现miRNA调控基因组30%以上的基因表达,参与细胞的增殖、分化以及凋亡等生物学过程。线粒体是细胞的能量加工厂,其拷贝数的多少决定了细胞能量代谢的水平,不同类型的细胞因其能量需求的差异使得线粒体含量有所不同。肌纤维的异质性与不同肌纤维类型之间的能量代谢差异密切相关,在慢肌中线粒体含量较高,主要进行有氧呼吸；而在快肌纤维中因其线粒体含量较低,主要进行无氧呼吸。在肉质研究中,慢肌纤维因其较高的线粒体含量和低的糖元浓度,而具有较低的糖酵解潜力,从而使慢肌纤维含量高的肌肉具有更好的肉质。本研究利用C2C12细胞,探究miR-23a和miR-27b对细胞线粒体拷贝数的影响,继而研究线粒体拷贝数变化引起的细胞能量代谢差异对成肌细胞分化和肌纤维类型组成的影响,结果如下：1.在Lipofectamine 2000和mimic(或inhibitor)浓度分别为1 .56μl/cm2和150nM时,C2C12细胞的转染效率达到最高,为43%...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 文献综述
1.1 miRNA的研究进展
1.1.1 miRNA的发现
1.1.2 miRNA的形成与作用机制
1.1.3 现代生物学技术在miRNA研究中的应用
1.1.4 miRNA靶基因预测与验证方法的研究
1.1.5 miR-23a和miR-27b的研究现状
1.2 肌纤维类型与肉质的研究进展
1.2.1 肌纤维的结构
1.2.2 肌纤维类型的分类方法
1.2.3 肌纤维类型的特征
1.2.4 肌纤维类型对肉质的影响
1.3 线粒体拷贝数的研究
1.3.1 线粒体的生物学功能
1.3.2 线粒体的生物合成
1.3.3 线粒体生成的转录调控
1.4 本实验的研究内容和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 实验试剂
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 肌肉miRNA高通量测序数据
2.1.4 组织、细胞总DNA
2.1.5 组织、细胞总RNA
2.1.6 引物合成
2.1.7 质粒、菌株和细胞系
2.2 试验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 组织和细胞总DNA提取
2.2.3 组织和细胞总RNA提取
2.2.4 mRNA反转录
2.2.5 miRNA反转录
2.2.6 PCR的扩增与条带检测
2.2.7 Real-time PCR
2.2.8 Foxj3和Mef2c基因部分3'-UTR的扩增及克隆测序
2.2.9 Foxj3和Mef2c基因部分3'-UTR的真核表达载体的构建
2.2.10 C2C12细胞的培养
2.2.11 Hela细胞的培养
2.2.12 荧光素酶活性检测
2.2.13 细胞线粒体染色
3 结果与分析
3.1 调控线粒体拷贝数MIRNA的筛选
3.2 miR-23a和miR-27b与靶基因结合位点的进化保守性分析
3.2.1 miR-23a和miR-27b与靶基因结合位点和二级结构分析
3.2.2 Mef2c与Foxj3基因的保守性和miR-23a与miR-27b的种子序列的保守性
3.3 Mef2c和Foxj3的3'-UTR片段双荧光素酶报告基因载体构建
3.3.1 Mef2c和Foxj3基因3'-UTR区扩增
3.3.2 重组质粒Mef2c 3'-UTR psiCHECKTM-2和Foxj3 3'-UTR psiCHECKTM-2构建与鉴定
3.3.3 重组质粒Mef2c 3'-UTR psiCHECKTM-2和Foxj3 3'-UTR psiCHECKTM-2的序列分析
3.4 miR-23a与Mef2c和miR-27b与Foxj3间靶基因关系的验证
3.5 miR-23a与miR-27b对C2C12细胞肌纤维类型的影响
3.5.1 C2C12转染效率的优化
3.5.2 C2C12增值和分化过程中miR-23a和miR-27b以及线粒体拷贝数的变化
3.5.3 过表达或抑制miR-23a和miR-27b对线粒体拷贝数的影响
3.5.6 miR-23a和miR-27b与线粒体和肌纤维类型的相关性在猪多个肌肉组织中的验证
4 讨论
4.1 miR-23a与miR-27b的筛选
4.2 C2C12细胞转染效率的优化
4.3 miR-23a与miR-27b对线粒体拷贝数和肌纤维类型的影响
5 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位之间发表的学术论文
本文编号：4043894
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【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 文献综述
1.1 miRNA的研究进展
1.1.1 miRNA的发现
1.1.2 miRNA的形成与作用机制
1.1.3 现代生物学技术在miRNA研究中的应用
1.1.4 miRNA靶基因预测与验证方法的研究
1.1.5 miR-23a和miR-27b的研究现状
1.2 肌纤维类型与肉质的研究进展
1.2.1 肌纤维的结构
1.2.2 肌纤维类型的分类方法
1.2.3 肌纤维类型的特征
1.2.4 肌纤维类型对肉质的影响
1.3 线粒体拷贝数的研究
1.3.1 线粒体的生物学功能
1.3.2 线粒体的生物合成
1.3.3 线粒体生成的转录调控
1.4 本实验的研究内容和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 实验试剂
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 肌肉miRNA高通量测序数据
2.1.4 组织、细胞总DNA
2.1.5 组织、细胞总RNA
2.1.6 引物合成
2.1.7 质粒、菌株和细胞系
2.2 试验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 组织和细胞总DNA提取
2.2.3 组织和细胞总RNA提取
2.2.4 mRNA反转录
2.2.5 miRNA反转录
2.2.6 PCR的扩增与条带检测
2.2.7 Real-time PCR
2.2.8 Foxj3和Mef2c基因部分3'-UTR的扩增及克隆测序
2.2.9 Foxj3和Mef2c基因部分3'-UTR的真核表达载体的构建
2.2.10 C2C12细胞的培养
2.2.11 Hela细胞的培养
2.2.12 荧光素酶活性检测
2.2.13 细胞线粒体染色
3 结果与分析
3.1 调控线粒体拷贝数MIRNA的筛选
3.2 miR-23a和miR-27b与靶基因结合位点的进化保守性分析
3.2.1 miR-23a和miR-27b与靶基因结合位点和二级结构分析
3.2.2 Mef2c与Foxj3基因的保守性和miR-23a与miR-27b的种子序列的保守性
3.3 Mef2c和Foxj3的3'-UTR片段双荧光素酶报告基因载体构建
3.3.1 Mef2c和Foxj3基因3'-UTR区扩增
3.3.2 重组质粒Mef2c 3'-UTR psiCHECKTM-2和Foxj3 3'-UTR psiCHECKTM-2构建与鉴定
3.3.3 重组质粒Mef2c 3'-UTR psiCHECKTM-2和Foxj3 3'-UTR psiCHECKTM-2的序列分析
3.4 miR-23a与Mef2c和miR-27b与Foxj3间靶基因关系的验证
3.5 miR-23a与miR-27b对C2C12细胞肌纤维类型的影响
3.5.1 C2C12转染效率的优化
3.5.2 C2C12增值和分化过程中miR-23a和miR-27b以及线粒体拷贝数的变化
3.5.3 过表达或抑制miR-23a和miR-27b对线粒体拷贝数的影响
3.5.6 miR-23a和miR-27b与线粒体和肌纤维类型的相关性在猪多个肌肉组织中的验证
4 讨论
4.1 miR-23a与miR-27b的筛选
4.2 C2C12细胞转染效率的优化
4.3 miR-23a与miR-27b对线粒体拷贝数和肌纤维类型的影响
5 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位之间发表的学术论文
本文编号：4043894
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