利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定

发布时间：2025-05-11 05:58

　　 近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)属于甲亚科疱疹病毒,血清I型MDV(MDV-1)感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病(Marek’s disease,MD)肿瘤发生中具有重要作用。本文以超强毒MDV(very virulent MDV,vvMDV)国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序。结果证实,meq基因被完全编辑并敲除。间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定。通过荧光定量PCR(quantitative PCR,...

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【文章目录】：
材料与方法
    1细胞、病毒、质粒和抗体
    2主要试剂
    3 gRNA及引物的设计与合成
    4 pX459-gRNA质粒构建
    5质粒转染及病毒感染
    6 PCR分析gRNA编辑效果
    7 meq基因编辑病毒的克隆及纯化
    8间接免疫荧光实验（Indirectimmunofluorescence assay,IFA)
    9病毒增殖曲线测定
结果
    1 pX459-gRNA质粒的构建及鉴定
    2 meq基因编辑及鉴定
    3 meq基因编辑病毒克隆纯化及稳定性分析
    4 meq基因编辑缺失毒株的IFA鉴定
    5 meq基因编辑缺失毒株的增殖曲线测定
讨论



本文编号：4044953