猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

发布时间：2025-05-20 07:01

　　 为了建立一种猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)TaqMan实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中6株PSV的基因组序列设计合成特异性引物和探针,优化扩增体系和程序,并完成敏感性试验、特异性试验、重复性试验及PSV阳性样品的检测。结果表明:优化后的特异性引物和探针浓度均为0.8μmol/L、退火温度为55℃;建立的PSV TaqMan实时荧光定量PCR方法的最低检测限为5×10～1拷贝/μL,TaqMan实时荧光定量PCR方法的敏感性比普通PCR方法高100倍;仅以PSV阳性质粒为模板进行的TaqMan实时荧光定量PCR检测有扩增曲线,其他对照病毒样品均未发生扩增;组间与组内变异系数均低于1%;对30份阳性病料进行检测,扩增结果均为阳性。说明试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法敏感性、特异性、重复性好,可用于PSV的临床检测。

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【部分图文】：

图1 重组质粒的酶切鉴定结果

2%琼脂糖凝胶电泳结果显示,得到大小为143bp的目的片段(见图1),与预期大小一致。经测序比对,PSV目的片段克隆成功。经测定质粒浓度为154.39ng/μL,根据公式计算质粒拷贝数为5.00×1010拷贝/μL,将质粒于-20℃保存,作为标准品质粒用于后续试验。

图2 标准曲线

对按梯度稀释的标准品质粒进行扩增,绘制标准曲线(见图2)。标准曲线的相关系数(R2)=0.98,扩增效率(E)=0.97,标准曲线斜率为-3.395,截距为40.07,标准曲线的线性关系表达式为y=-3.395x+40.07。3.4敏感性试验

图3 敏感性试验结果

目前检测PSV的方法主要有病原学检测、分子生物学鉴定。病原学检测即是对病毒进行细胞培养后通过电镜观察分析病毒粒子形态学结构,目前PSV的嗜性细胞有猪肾细胞(IBRS-2)、乳仓鼠肾细胞(BHK-21)、猪肾贴壁细胞(LLC-PK)等[5-6],由于PSV对细胞培养条件的要求较严苛....

图4 特异性试验结果

图3敏感性试验结果

本文编号：4047031