MAPK-CEBPβ对猪颗粒细胞凋亡、周期及类固醇激素分泌的调控作用和机制的研究

发布时间：2025-06-26 06:29

　　哺乳动物卵泡发育包括卵泡的生长和卵泡闭锁。卵泡的生长包括颗粒细胞的增殖、分化和周期的控制。然而,卵泡生长的过程中,只有少数的卵泡可以生长发育到排卵,大部分的卵泡在卵泡发育的过程中发生闭锁。研究发现,卵泡闭锁退化的过程是由卵泡中颗粒细胞的凋亡触发的,颗粒细胞的凋亡最终导致卵泡的闭锁。在卵泡颗粒细胞中可以分泌类固醇激素、促卵泡素和促黄体素等激素,还可以产生一些细胞因子,调控着卵泡和卵母细胞的生长发育。因此体外培养颗粒细胞模型是研究卵泡发育过程中基因调控的分子机制的必须模型。而颗粒细胞的凋亡也是一个复杂的过程,凋亡机制尚不十分明确。本研究通过体外培养猪颗粒细胞,利用体外添加抑制剂培养、RNA干扰、western blot (WB)、real time PCR、流式细胞仪检测、ELISA检测等方法,研究MAPK-CEBPβ通路对猪颗粒细胞中关键基因的表达、颗粒细胞中类固醇激素的分泌、颗粒细胞的凋亡和周期及其它们的调控机制的影响,揭示MAPK-CEBPp对猪颗粒细胞生长发育调控机制,进而获得该通路通过对颗粒细胞的调控参与对猪卵泡发育排卵、颗粒细胞黄体化的调控机制。本实验分为两个部分： 实验一：...

【文章页数】：103 页

【学位级别】：博士

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目录
摘要
Abstract
缩略词（Abbreviation)
第一章 文献综述
    前言
    1 卵泡发育
    2 卵泡发育的调控
        2.1 生殖激素对卵泡发育的调节
            2.1.1 促性腺激素释放激素
            2.1.2 促性腺激素
            2.1.3 类固醇激素
        2.2 细胞因子对卵泡发育的调节
            2.2.1 胰岛素样生长因子(IGF)
            2.2.2 表皮生长因子(EGF)
            2.2.3 转化生长因子(TGF)和肿瘤坏死因子(TNF)
    3 卵泡发育及排卵调控通路的研究
        3.1 MAPK-CEBPα/β信号通路在卵泡发育及排卵中的作用
        3.2 PKC信号通路在卵泡发育及排卵中的作用
        3.3 cAMP-PKA信号通路在卵泡发育及排卵中的作用
        3.4 钙离子信号通路在卵泡发育及排卵中的作用
        3.6 其他相关因子在卵泡发育及排卵中的作用
    4 颗粒细胞凋亡
        4.1 细胞凋亡的概念
        4.3 细胞凋亡的生物学意义
        4.4 颗粒细胞凋亡的研究
        4.5 颗粒细胞与卵泡及卵母细胞发育
    5 研究目的与意义
第二章 U0126和RU486对猪卵泡颗粒细胞的作用及其机制研究
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 材料
            2.1.1 实验材料
            2.1.2 主要试剂盒
        2.2 方法
            2.2.1 猪卵泡颗粒细胞的分离、培养和处理
            2.2.2 颗粒细胞总蛋白的提取
            2.2.3 颗粒细胞总RNA提取及检测
            2.2.4 RT-PCR合成第一链cDNA
            2.2.5 颗粒细胞凋亡、周期、激素分泌相关基因的相对表达量分析
            2.2.6 Western blot分析
            2.2.7 U0126和RU486对猪颗粒细胞凋亡影响检测
            2.2.8 U0126和RU486对猪颗粒细胞周期的影响检测
            2.2.9 U0126和RU486对颗粒细胞中类固醇激素分泌量影响检测
        2.3 统计分析
    3. 结果与分析
        3.1 LH/hCG对猪颗粒细胞中CEBPβ表达水平的影响
        3.2 U0126和RU486对猪颗粒细胞形态的影响
        3.3 U0126和RU486对CEBPβ及相关基因蛋白水平的影响
        3.4 FBS不影响U0126和RU486对猪颗粒细胞的作用
        3.5 U0126和RU486对p-p38MAPK蛋白表达的调控
        3.6 U0126和RU486显著改变猪颗粒细胞周期
        3.7 U0126和RU486显著影响猪颗粒细胞凋亡的变化
        3.8 U0126和RU486显著降低猪颗粒细胞中类固醇激素分泌
        3.9 猪颗粒细胞总RNA检测
        3.10 U0126和RU486对颗粒细胞CEBPβ mRNA水平的影响
        3.11 U0126和RU486对颗粒细胞中周期及凋亡相关基因mRNA水平的影响
        3.12 U0126和RU486对颗粒细胞中4个重要功能基因mRNA水平的影响
    4 讨论分析
        4.1 LH和hCG显著促进颗粒细胞CEBPβ的表达
        4.2 U0126和RU486显著影响CEBPβ和p-ERK1/2蛋白的表达
            4.2.1 U0126显著降低猪颗粒细胞中CEBPβ蛋白的表达
            4.2.2 RU486显著降低猪颗粒细胞中CEBPβ和p-ERK1/2蛋白的表达
        4.3 FBS不影响U0126和RU486对猪颗粒细胞的作用
        4.4 U0126和RU486可能通过p-p38MAPK调控CEBPβ的表达
        4.5 U0126和RU486显著影响猪颗粒细胞的凋亡
            4.5.1 U0126抑制猪颗粒细胞的凋亡
            4.5.2 RU486促进猪颗粒细胞的凋亡
            4.5.3 猪颗粒细胞凋亡基因的相对表达变化
        4.6 U0126和RU486显著影响猪颗粒细胞周期的分布
            4.6.1 U0126显著改变猪颗粒细胞周期的分布
            4.6.2 RU486显著改变猪颗粒细胞周期的分布
            4.6.3 U0126和RU486显著影响猪颗粒细胞周期调控基因的相对表达量
        4.7 U0126和RU486显著降低猪颗粒细胞中类固醇激素水平
        4.8 U0126和RU486调控猪颗粒细胞中关键功能基因的表达
        4.9 U0126和RU486对猪颗粒细胞的的调控机制
    5 小结
第三章 干扰CEBPβ对猪卵泡颗粒细胞的影响及其机制研究
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 材料
            2.1.1 实验材料
            2.1.2 干扰载体
            2.1.3 主要试剂盒
        2.2 方法
            2.2.1 猪卵泡颗粒细胞的分离和培养
            2.2.2 CEBPβ基因RNAi重组干扰质粒构建
            2.2.3 重组质粒克隆及纯化
            2.2.4 重组质粒转染猪颗粒细胞
            2.2.5 颗粒细胞总蛋白的提取
            2.2.6 颗粒细胞总RNA提取及检测
            2.2.7 RT-PCR合成第一链cDNA
            2.2.8 颗粒细胞中基因的相对表达量检测
            2.2.9 Western blot分析
            2.2.10 颗粒细胞凋亡检测
            2.2.11 颗粒细胞周期检测
            2.2.12 颗粒细胞类固醇激素分泌量检测
        2.3 统计分析
    3 结果与分析
        3.1 CEBPβ基因RNAi重组质粒
        3.2 重组质粒CEBPβ转染猪颗粒细胞
        3.3 猪颗粒细胞总RNA提取检测
        3.4 CEBPβRNAi重组质粒干扰效率mRNA水平检测
        3.5 CEBPβ RNAi后对CEBPβ及p-ERK1/2蛋白水平影响
        3.6 CEBPβ RNA干扰对激素分泌水平及调控的影响
        3.7 CEBPβ RNA干扰对猪颗粒细胞周期的影响
        3.8 CEBPβ RNA干扰对猪颗粒细胞凋亡的影响
        3.9 CEBPβ RNA干扰对颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响
        3.10 CEBPβ RNA对颗粒细胞中4个重要功能基因表达的影响
    4 讨论分析
        4.1 CEBPβ基因RNAi效果显著
        4.2 CEBPβ干扰后增加p-ERK1/2的蛋白表达,降低ERK2蛋白表达
        4.3 CEBPβ对猪颗粒细胞凋亡的影响
        4.4 CEBPβ显著改变猪颗粒细胞周期的分布
        4.5 CEBPβ显著提高猪颗粒细胞类固醇激素水平
        4.6 CEBPβ显著影响猪颗粒细胞中关键功能基因的表达
        4.7 CEBPβ促进颗粒细胞凋亡的作用机制
    5 小结
全文结论
创新与不足
参考文献
已发表论文
致谢



本文编号：4053309