BVDV非结构蛋白N pro 介导泛素化降解ELF4的分子机制研究
发布时间：2025-07-07 00:09
牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus）是一种单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、瘟病毒属的成员,主要引起牛的呼吸道症状,腹泻,黏膜糜烂,流产或产出先天缺陷的犊牛等症状,还能引起白细胞减少和免疫抑制。Npro蛋白是ORF中编码的第一种蛋白质,在瘟病毒属中高度保守,具有蛋白酶活性,但目前尚不能完全解释其蛋白水解作用及参与调控免疫抑制的机理。据报道BVDV Npro蛋白通过蛋白酶体途径降解IRF3,并且E1泛素激活酶起到了作用;转录因子ELF4可形成二聚体入核激活I型IFN启动子,诱导I型IFN产生,并参与机体的抗病毒先天免疫反应。我们前期研究证明:BVDV非结构蛋白Npro通过蛋白酶体途径降解BoELF4,负调控I型干扰素的表达;但是Npro蛋白降解ELF4蛋白过程中的作用机制尚不完全清楚。由此,本研究探讨了BVDV Npro蛋白通过泛素化途径降解ELF4的分子机制,以及筛选了与Npro蛋白互作的蛋白,为深入了解Npr...
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 引言
1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展
1.2.1 流行病学
1.2.2 发病机理
1.2.3 诊断
1.2.4 病原学
1.2.5 BVDV结构与功能
1.2.6 BVDV引起的免疫反应
1.3 天然免疫中的泛素化修饰
1.3.1 泛素化修饰的简介
1.3.2 泛素化修饰参与调控抗病毒天然免疫
1.4 转录因子ELF4
1.4.1 ETS家族的简介
1.4.2 ELF4的功能
1.5 热休克蛋白Hsp70
1.5.1 热休克蛋白Hsp70的简介
1.5.2 Hsp70系统在病毒生命周期中的功能
1.6 研究的目的及意义
2 牛病毒性腹泻病毒Npro真核表达载体的构建及鉴定
2.1 材料
2.1.1 载体、细胞和病毒
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 细胞培养与病毒增殖
2.2.2 病毒及细胞的RNA提取及反转录
2.2.3 BVDV Npro基因的克隆及分析
2.2.4 BVDV Npro蛋白真核表达载体的构建
2.2.5 293T细胞的转染
2.2.6 重组蛋白pcDNA3.1-Npro Western blot的鉴定
2.3 结果
2.3.1 BVDV NADL株接种MDBK细胞结果
2.3.2 Npro基因PCR的扩增
2.3.3 重组质粒p MD-18T-Npro的鉴定
2.3.4 BVDV Npro蛋白生物信息学分析
2.3.5 真核表达产物pcDNA3.1-Npro的鉴定
2.3.6 重组蛋白pcDNA3.1-Npro的Western blot鉴定
2.4 讨论
2.5 小结
3 BVDV非结构蛋白Npro通过K48位多聚泛素化降解ELF4
3.1 材料
3.1.1 细胞及质粒
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 蛋白互作的预测
3.2.2 ELF4泛素化位点的预测
3.2.3 转化
3.2.4 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定
3.2.5 重组蛋白p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定
3.2.6 免疫共沉淀试验
3.3 结果
3.3.1 蛋白互作预测结果
3.3.2 ELF4泛素化位点的预测及分布
3.3.3 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定
3.3.4 ELF4蛋白Western blot的鉴定
3.3.5 通过Co-IP试验分析Npro和ELF4的相互作用
3.3.6 Npro降解ELF4的K48位多聚泛素化
3.4 讨论
3.5 小结
4 筛选BVDV Npro互作蛋白及对ELF4的影响
4.1 材料
4.1.1 质粒、细胞、病毒
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 检测Npro在MDBK细胞中的表达
4.2.2 BCA试剂盒检测蛋白浓度
4.2.3 快速银染试验
4.2.4 免疫共沉淀试验
4.2.5 牛Hsp70基因引物的设计与合成
4.2.6 牛Hsp70基因的扩增
4.2.7 牛Hsp70基因真核表达载体的构建
4.2.8 磷酸钙沉淀转染
4.3 结果
4.3.1 Npro质粒在MDBK细胞中的表达情况
4.3.2 Co-IP中Npro蛋白总量的测定
4.3.3 Co-IP试验结果
4.3.4 LC-MS/MS质谱技术鉴定SDS-PAGE胶中的所有蛋白
4.3.5 候选蛋白分析结果
4.3.6 牛源Hsp70基因的扩增
4.3.7 真核表达产物pcDNA3.0-Hsp70双酶切鉴定
4.3.8 牛源Hsp70质粒的表达
4.3.9 BVDV Npro蛋白与Hsp70的相互作用
4.3.10 转染Hsp70质粒对BoELF4蛋白水平的影响
4.4 讨论
4.5 小结
5 结论
参考文献
致谢
附录
个人简历
本文编号：4056186
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 引言
1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展
1.2.1 流行病学
1.2.2 发病机理
1.2.3 诊断
1.2.4 病原学
1.2.5 BVDV结构与功能
1.2.6 BVDV引起的免疫反应
1.3 天然免疫中的泛素化修饰
1.3.1 泛素化修饰的简介
1.3.2 泛素化修饰参与调控抗病毒天然免疫
1.4 转录因子ELF4
1.4.1 ETS家族的简介
1.4.2 ELF4的功能
1.5 热休克蛋白Hsp70
1.5.1 热休克蛋白Hsp70的简介
1.5.2 Hsp70系统在病毒生命周期中的功能
1.6 研究的目的及意义
2 牛病毒性腹泻病毒Npro真核表达载体的构建及鉴定
2.1 材料
2.1.1 载体、细胞和病毒
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 细胞培养与病毒增殖
2.2.2 病毒及细胞的RNA提取及反转录
2.2.3 BVDV Npro基因的克隆及分析
2.2.4 BVDV Npro蛋白真核表达载体的构建
2.2.5 293T细胞的转染
2.2.6 重组蛋白pcDNA3.1-Npro Western blot的鉴定
2.3 结果
2.3.1 BVDV NADL株接种MDBK细胞结果
2.3.2 Npro基因PCR的扩增
2.3.3 重组质粒p MD-18T-Npro的鉴定
2.3.4 BVDV Npro蛋白生物信息学分析
2.3.5 真核表达产物pcDNA3.1-Npro的鉴定
2.3.6 重组蛋白pcDNA3.1-Npro的Western blot鉴定
2.4 讨论
2.5 小结
3 BVDV非结构蛋白Npro通过K48位多聚泛素化降解ELF4
3.1 材料
3.1.1 细胞及质粒
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 蛋白互作的预测
3.2.2 ELF4泛素化位点的预测
3.2.3 转化
3.2.4 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定
3.2.5 重组蛋白p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定
3.2.6 免疫共沉淀试验
3.3 结果
3.3.1 蛋白互作预测结果
3.3.2 ELF4泛素化位点的预测及分布
3.3.3 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定
3.3.4 ELF4蛋白Western blot的鉴定
3.3.5 通过Co-IP试验分析Npro和ELF4的相互作用
3.3.6 Npro降解ELF4的K48位多聚泛素化
3.4 讨论
3.5 小结
4 筛选BVDV Npro互作蛋白及对ELF4的影响
4.1 材料
4.1.1 质粒、细胞、病毒
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 检测Npro在MDBK细胞中的表达
4.2.2 BCA试剂盒检测蛋白浓度
4.2.3 快速银染试验
4.2.4 免疫共沉淀试验
4.2.5 牛Hsp70基因引物的设计与合成
4.2.6 牛Hsp70基因的扩增
4.2.7 牛Hsp70基因真核表达载体的构建
4.2.8 磷酸钙沉淀转染
4.3 结果
4.3.1 Npro质粒在MDBK细胞中的表达情况
4.3.2 Co-IP中Npro蛋白总量的测定
4.3.3 Co-IP试验结果
4.3.4 LC-MS/MS质谱技术鉴定SDS-PAGE胶中的所有蛋白
4.3.5 候选蛋白分析结果
4.3.6 牛源Hsp70基因的扩增
4.3.7 真核表达产物pcDNA3.0-Hsp70双酶切鉴定
4.3.8 牛源Hsp70质粒的表达
4.3.9 BVDV Npro蛋白与Hsp70的相互作用
4.3.10 转染Hsp70质粒对BoELF4蛋白水平的影响
4.4 讨论
4.5 小结
5 结论
参考文献
致谢
附录
个人简历
本文编号：4056186
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