酵母细胞人源化重组突触囊泡SNARE融合机制及应用研究
发布时间：2025-06-20 04:21
在人类神经网络中,神经元之间的信号传输是由神经递质介导的,而神经递质的释放是由突触囊泡融合调控的。在突触囊泡融合过程中,syntaxin-1A、VAMP2和SNAP-25这三个可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SolubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SNARE）蛋白通过它们的SNARE区域相互结合形成SNARE复合物,在许多蛋白及因子共同调控下,突触囊泡与突触前膜融合,最终完成神经递质的释放。膜融合的调控过程极其复杂,目前仍有一些调控蛋白的机制尚未解释清楚。由于真核细胞中膜融合机制的高度保守性,酵母细胞与人体细胞共享SNARE膜融合机制,其中syntaxin-1A、VAMP2和SNAP-25的直系同源蛋白Sso1/2、Snc1/2和Sec9在酵母胞外分泌过程中形成SNARE复合物并调控这个过程。人类神经递质释放受到抑制会引起各种神经性疾病,而酵母的胞外分泌过程受到抑制会影响酵母的生长。基于酵母基因操作简单、生长周期短等优点,可以将人类的神经元膜融合过程重构到酵母中,在酵母中研究神...
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词索引表
第一章 绪论
1.1 概述
1.1.1 突触囊泡的循环
1.1.2 囊泡膜融合机制-SNARE假说
1.2 参与调控囊泡融合过程的几种重要蛋白的概述
1.2.1 SNARE蛋白
1.2.2 SM蛋白
1.2.3 Tomosyn蛋白
1.3 肉毒神经毒素
1.3.1 肉毒神经毒素的概述
1.3.2 BoNTs的分子结构
1.3.3 BoNTs神经末梢中毒的机制
1.4 人源化酵母概述
1.5 本论文的研究意义和内容
1.5.1 立题依据及研究意义
1.5.2 论文主要研究内容
第二章 Sso1/STX1A不能替换Sso1和Sso2 功能的原因分析
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 试剂和仪器
2.2.3 培养基
2.2.4 分子生物学操作
2.3 结果
2.3.1 Sso1/STX1A重组蛋白在酵母中功能的验证
2.3.2 Sso1和Sso1/STX1A重组蛋白在酵母中蛋白表达水平分析
2.3.3 Sso1和Sso1/STX1A重组蛋白荧光定位分析
2.3.4 突变发生在SSO1的Habc区域的Sso1/STX1A突变体的筛选
2.3.5 Sso1/STX1AD133V蛋白表达水平以及荧光定位的分析
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 syntaxin家族SNARE蛋白的特性分析
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 菌株和质粒
3.2.2 试剂和仪器
3.2.3 培养基
3.2.4 分子生物学操作
3.3 结果
3.3.1 Sso1/STX1A重组蛋白在ER中与Snc1和Sec9 相互作用的研究
3.3.2 异常SNARE复合体的形成是否导致Sso1/STX1A运输缺陷的分析
3.3.3 Syntaxin-1A的 SNARE区域是否与Snc1和Sec9 发生相互作用的分析.
3.3.4 A220E突变能否破坏syntaxin-1A SNARE区域形成异常SNARE复合体的特性的分析
3.3.5 Munc-18 能否阻止syntaxin-1A形成异常SNARE复合体的分析
3.3.6 Syntaxin-1A以及Sso1的SNARE区域能否发生自身相互作用的分析
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 5-FOA药物筛选获得Sso1/STX1A能替换Sso1和Sso2 功能的酵母突变菌株及其分析
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 菌株和质粒
4.2.2 试剂和仪器
4.2.3 培养基
4.2.4 分子生物学操作
4.3 结果与讨论
4.3.1 5-FOA药物筛选Sso1/STX1A重组蛋白功能回补的sso1?sso2?双敲除菌株
4.3.2 孢子四分体拆分法分离所得菌株中的突变
4.3.3 酵母全基因组测序结果及其分析
4.3.4 所得候选突变基因的功能在sso1?sso2?双敲除菌株中的回补验证
4.3.5 GFA1 突变体对Sso1/STX1A重组蛋白荧光定位的影响
4.3.6 GFA1基因G373D突变引起细胞壁几丁质含量上升
4.3.7 壳聚糖合成途径其他基因过表达对sso1?sso2?双敲除菌株生长的影响
4.3.8 Gfa1 的人源直系同源蛋白GFAT1 在酵母中的研究
4.4 本章小结
第五章 利用人源化酵母模型分析BoNT/C轻链活性
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 菌株和质粒
5.2.2 试剂和仪器
5.2.3 培养基
5.2.4 分子生物学操作
5.3 结果
5.3.1 BoNT/C的表达对野生型酵母生长影响的分析
5.3.2 BoNT/C在酵母中活性的验证
5.3.3 Bo NT/C的表达对含有Sso1/STX1AD133V的sso1?sso2?双敲除酵母生长影响的分析
5.3.4 不同Sso1/STX1A重组蛋白对Bo NT/C敏感性的验证
5.4 讨论
5.5 本章小结
第六章 建立一个用于tomosyn功能分析的酵母模型
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 菌株和质粒
6.2.2 试剂和仪器
6.2.3 培养基
6.2.4 分子生物学操作
6.3 结果与讨论
6.3.1 过表达tomosyn对野生型酵母生长影响的分析
6.3.2 过表达tomosyn对含有Sso1/STX1AD133V的sso1?sso2?双敲除酵母生长影响的分析
6.3.3 Tomosyn和 syntaxin-1A在酵母中的相互作用分析
6.3.4 Syntaxin-1A与 tomosyn结合所需要区域的分析
6.4 本章小结
主要结论与展望
主要结论
展望
论文创新点
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文
本文编号：4051416
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词索引表
第一章 绪论
1.1 概述
1.1.1 突触囊泡的循环
1.1.2 囊泡膜融合机制-SNARE假说
1.2 参与调控囊泡融合过程的几种重要蛋白的概述
1.2.1 SNARE蛋白
1.2.2 SM蛋白
1.2.3 Tomosyn蛋白
1.3 肉毒神经毒素
1.3.1 肉毒神经毒素的概述
1.3.2 BoNTs的分子结构
1.3.3 BoNTs神经末梢中毒的机制
1.4 人源化酵母概述
1.5 本论文的研究意义和内容
1.5.1 立题依据及研究意义
1.5.2 论文主要研究内容
第二章 Sso1/STX1A不能替换Sso1和Sso2 功能的原因分析
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 试剂和仪器
2.2.3 培养基
2.2.4 分子生物学操作
2.3 结果
2.3.1 Sso1/STX1A重组蛋白在酵母中功能的验证
2.3.2 Sso1和Sso1/STX1A重组蛋白在酵母中蛋白表达水平分析
2.3.3 Sso1和Sso1/STX1A重组蛋白荧光定位分析
2.3.4 突变发生在SSO1的Habc区域的Sso1/STX1A突变体的筛选
2.3.5 Sso1/STX1AD133V蛋白表达水平以及荧光定位的分析
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 syntaxin家族SNARE蛋白的特性分析
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 菌株和质粒
3.2.2 试剂和仪器
3.2.3 培养基
3.2.4 分子生物学操作
3.3 结果
3.3.1 Sso1/STX1A重组蛋白在ER中与Snc1和Sec9 相互作用的研究
3.3.2 异常SNARE复合体的形成是否导致Sso1/STX1A运输缺陷的分析
3.3.3 Syntaxin-1A的 SNARE区域是否与Snc1和Sec9 发生相互作用的分析.
3.3.4 A220E突变能否破坏syntaxin-1A SNARE区域形成异常SNARE复合体的特性的分析
3.3.5 Munc-18 能否阻止syntaxin-1A形成异常SNARE复合体的分析
3.3.6 Syntaxin-1A以及Sso1的SNARE区域能否发生自身相互作用的分析
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 5-FOA药物筛选获得Sso1/STX1A能替换Sso1和Sso2 功能的酵母突变菌株及其分析
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 菌株和质粒
4.2.2 试剂和仪器
4.2.3 培养基
4.2.4 分子生物学操作
4.3 结果与讨论
4.3.1 5-FOA药物筛选Sso1/STX1A重组蛋白功能回补的sso1?sso2?双敲除菌株
4.3.2 孢子四分体拆分法分离所得菌株中的突变
4.3.3 酵母全基因组测序结果及其分析
4.3.4 所得候选突变基因的功能在sso1?sso2?双敲除菌株中的回补验证
4.3.5 GFA1 突变体对Sso1/STX1A重组蛋白荧光定位的影响
4.3.6 GFA1基因G373D突变引起细胞壁几丁质含量上升
4.3.7 壳聚糖合成途径其他基因过表达对sso1?sso2?双敲除菌株生长的影响
4.3.8 Gfa1 的人源直系同源蛋白GFAT1 在酵母中的研究
4.4 本章小结
第五章 利用人源化酵母模型分析BoNT/C轻链活性
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 菌株和质粒
5.2.2 试剂和仪器
5.2.3 培养基
5.2.4 分子生物学操作
5.3 结果
5.3.1 BoNT/C的表达对野生型酵母生长影响的分析
5.3.2 BoNT/C在酵母中活性的验证
5.3.3 Bo NT/C的表达对含有Sso1/STX1AD133V的sso1?sso2?双敲除酵母生长影响的分析
5.3.4 不同Sso1/STX1A重组蛋白对Bo NT/C敏感性的验证
5.4 讨论
5.5 本章小结
第六章 建立一个用于tomosyn功能分析的酵母模型
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 菌株和质粒
6.2.2 试剂和仪器
6.2.3 培养基
6.2.4 分子生物学操作
6.3 结果与讨论
6.3.1 过表达tomosyn对野生型酵母生长影响的分析
6.3.2 过表达tomosyn对含有Sso1/STX1AD133V的sso1?sso2?双敲除酵母生长影响的分析
6.3.3 Tomosyn和 syntaxin-1A在酵母中的相互作用分析
6.3.4 Syntaxin-1A与 tomosyn结合所需要区域的分析
6.4 本章小结
主要结论与展望
主要结论
展望
论文创新点
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文
本文编号：4051416
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