脑胶质瘤中基因的甲基化水平与miR-101介导的组蛋白甲基化修饰机制

发布时间：2025-06-26 03:36

　　[本课题前期研究工作基础] 脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,生存率低,研究表明,miRNA表达异常、DNA甲基化状态改变、组蛋白修饰等表观遗传机制的异常在脑胶质瘤的发生发展中发挥着重要的作用。本实验室前期采用最新高通量甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)结合启动子区及CpG岛芯片技术,筛选并初步建立脑胶质瘤基因组DNA甲基化谱。通过Massarray、亚硫酸氢盐修饰直接测序法(BSP)等进行检测,发现并验证了LRRC4等9个脑胶质瘤中新的高甲基化基因。通过HPLC-DAD技术对全基因组甲基化分析发现,抑瘤性miR-185可通过直接靶向DNMT1的表达而影响全基因组的甲基化水平,进而调控上述高甲基化基因在脑胶质瘤中的甲基化修饰状态,恢复这些基因在脑胶质瘤中的表达。 [确定F10、POTEH, CPEB1、LMO3、ELFN2及PRDM16为脑胶质瘤中新的低甲基化基因,其甲基化状态和表达与脑胶质瘤患者的预后密切相关] 在上述研究工作基础上,本课题利用Signalmap软件对甲基化芯片筛选出的74个低甲基化基因进行再次筛选,挑选出F10、POTEH、 CPEB1、LMO...

【文章页数】：155 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
主要縮略词简表
第一章 前言
第二章 材料与方法
    1 材料
        1.1 细胞系和组织样本
        1.2 菌株和质粒载体
        1.3 试剂
        1.4 主要仪器
    2 方法
        2.1 细胞基因组DNA提取(根据试剂盒说明书进行操作)
        2.2 细胞RNA制备
        2.3 细胞蛋白抽提及定量
        2.4 Western blot检测
        2.5 质粒、miRNA或siRNA转染目的细胞
        2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测
        2.7 免疫组织化学法
        2.8 原位杂交
        2.9 免疫组织化学法和原位杂交结果分析
        2.10 细胞计数实验
        2.11 细胞划痕实验
        2.12 组蛋白甲基转移酶活性检测(根据试剂盒说明书进行操作)
        2.13 组蛋白去甲基化酶活性检测(根据试剂盒说明书进行操作)
        2.14 DNA甲基转移酶活性或DNMT3A活性检测
        2.15 亚硫酸氢盐修饰样品gDNA制备(根据试剂盒说明书进行操作)
        2.16 直接测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
        2.17 甲基化特异性PCR(Methylated specific PCR,MSP)
        2.18 载体构建
        2.19 荧光报告素酶活性分析
        2.20 ChIP检测(按照试剂盒说明书操作)
        2.21 统计学分析
第三章 结果
    第一部分 全基因组DNA甲基化谱中低甲基化基因的验证及其与临床相关性研究
        1.1 全基因组DNA甲基化谱中低甲基化基因的重新筛选与验证
        1.2 低甲基化基因F10、POTEH、CPEB1、LMO3、ELFN2及PRDM16在脑胶质瘤组织中的表达及其与基因低甲基化的关系
        1.3 低甲基化基因的甲基化状态与患者临床参数及预后的关系
        1.4 低甲基化基因的表达与患者临床参数及预后的关系
        小结
    第二部分 miR-101调控脑胶质瘤中低甲基化基因的甲基化水平和其表达的作用机制
        2.1 脑胶质瘤中调控低甲基化基因的miRNA的预测
        2.2 miR-101在脑胶质瘤组织和细胞中的表达及其与脑胶质瘤患者临床参数和预后预测的关系分析
        2.3 miR-101抑制脑胶质瘤细胞的增殖和迁移能力
        2.4 低甲基化基因CPEB1、LMO3、ELFN2及PRDM16作为miR-101靶基因的验证
        2.5 miR-101通过直接靶向抑制组蛋白甲基化转移酶EZH2、EED和DNA甲基化转移酶DNMT3A影响LMO3基因核心启动子区的组蛋白甲基化修饰,调控LM03的甲基化水平,抑制其表达
        2.6 miR-101通过靶向抑制EZH2、EED及DNMT3A影响CPEB1、ELFN及PRDM16基因启动子区的组蛋白甲基化修饰而调控它们的甲基化状态,间接抑制其表达
        小结
    第三部分 miR-101通过组蛋白甲基化修饰调控脑胶质瘤中高甲基化基因LRRC的作用机制
        3.1 miR-101间接调控脑胶质瘤细胞中的高甲基化基因LRRC4的表达
        3.2 miR-101通过靶向EZH2、EED及DNMT3A影响脑胶质瘤细胞中LRRC4基因核心启动子区的组蛋白甲基化修饰,减低LRRC4基因的高甲基化水平,间接恢复其在脑胶质瘤细胞中的表达
        3.3 高甲基化基因LRRC4表达与脑胶质瘤患者预后预测的关系
第四章 讨论
    第一部分 全基因组甲基化芯片中低甲基化基因的验证及其与临床相关性研究
        1.1 发现并证实了脑胶质瘤中6个新的低甲基化基因
        1.2 F10、POTEH、CPEB1、ELFN2、LMO3及PRDM16在脑胶质瘤中的低甲基化或高表达可以作为脑胶质瘤患者预后预测的重要标志
    第二部分 miR-101调控脑胶质瘤中低甲基化基因甲基化水平及表达的作用机制
        2.1 miR-101在脑胶质瘤组织和细胞中的表达及其与脑胶质瘤患者临床参数和预后预测的关系分析
        2.2 miR-101直接靶向抑制低甲基化基因CPEB1、ELFN2、PRDM16的表达
        2.3 miR-101通过靶向抑制组蛋白甲基转移酶EZH2、EED及DNA甲基转移酶DNMT3A的表达,调控低甲基化基因核心启动子区组蛋白甲基化修饰,影响它们的甲基化状态,间接抑制它们在脑胶质瘤细胞中的表达
    第三部分 miR-101调控脑胶质瘤中高甲基化基因LRRC4的作用机制
结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
攻读博士学位期间主要研究成果



本文编号：4053093