ROCK2通过稳定PFKFB3的表达促进骨肉瘤生长和转移作用研究

发布时间：2025-06-18 23:51

　　研究背景和目的:骨肉瘤是最为常见的骨组织来源的恶性肿瘤,同时也是儿童恶性肿瘤的主要类型之一。其具有恶性程度高、生长迅速、易发生侵袭及迁移等特点,患者整体预后差,术后生存率低下。因此,有效的分子靶点对骨肉瘤的治疗极其重要。ROCK2在肿瘤的进展中扮演着重要角色,目前认为其可以调节细胞的收缩与粘附、侵袭及迁移、增殖和凋亡,然而其在骨肉瘤中的表达及影响机制并不清楚。在肿瘤的恶性进展中糖酵解水平显著提升,PFKFB3作为糖酵解及能量代谢的调节者,研究证实其在肿瘤的发展中起着关键性作用,然而,PFKFB3在骨肉瘤中的作用及机制研究却很少。本研究旨在探讨骨肉瘤中ROCK2及PFKFB3的表达及相关性,进一步深入探究其影响骨肉瘤生长及转移的机制。方法:1、免疫组化、荧光定量PCR及免疫印迹法分析ROCK2在骨肉瘤组织中的表达。2、筛选出下调效果最佳的shROCK2质粒并下调骨肉瘤细胞中ROCK2的表达,通过CCK8、EdU实验观察细胞生长能力的变化。然后采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡比例变化。接下来通过划痕愈合和Transwell实验观察细胞侵袭及迁移能力的影响。最后我们利用稳定转染shNC/U2-...

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
中英文缩略词表
前言
第1章 骨肉瘤组织及细胞中ROCK2 的表达水平
    1.1 引言
    1.2 材料与方法
        1.2.1 材料
        1.2.2 RNA的提取及聚合酶链反应(PCR)
        1.2.3 蛋白免疫印迹反应(Western blot)
        1.2.4 HE染色
        1.2.5 免疫组织化学方法
        1.2.6 统计学分析
    1.3 结果
        1.3.1 骨肉瘤组织中ROCK2 的表达情况
        1.3.2 骨肉瘤细胞中ROCK2 的表达情况
    1.4 讨论
    1.5 结论
第2章 ROCK2 蛋白对骨肉瘤生长和转移的影响
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 细胞培养
        2.2.3 shROCK2 质粒的构建
        2.2.4 qRT-PCR实验步骤
        2.2.5 Western blot
        2.2.6 CCK8 实验步骤
        2.2.7 EdU实验步骤
        2.2.8 流式细胞周期及凋亡
        2.2.9 Transwell实验
        2.2.10 划痕实验
        2.2.11 动物实验
        2.2.12 统计学分析
    2.3 结果
        2.3.1 ROCK2 最佳干扰质粒的筛选
        2.3.2 CCK8及EdU实验检测降低ROCK2 表达后增殖能力影响
        2.3.3 细胞周期实验检测降低ROCK2 表达后细胞的周期影响
        2.3.4 流式凋亡实验检测降低ROCK2 表达后细胞的凋亡的影响
        2.3.5 Transwell实验检测降低ROCK2 表达后侵袭及迁移影响
        2.3.6 划痕实验检测降低ROCK2 基因表达后迁移影响
        2.3.7 体内实验证实干扰ROCK2 表达细胞增殖能力的影响
        2.3.8 体内实验证实干扰ROCK2 表达对转移能力的影响
    2.4 讨论
    2.5 结论
第3章 ROCK2 调控骨肉瘤的生长及转移依赖于PFKFB3 的表达
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 细胞培养
        3.2.3 质粒的构建
        3.2.4 EdU实验步骤:
        3.2.5 Transwell:
        3.2.6 Western blot实验步骤
        3.2.7 qRT-PCR实验步骤
        3.2.8 统计学分析
    3.3 结果
        3.3.1 pcDNA3.1-(+)-ROCK2 质粒的表达
        3.3.2 PFKFB3 在骨肉瘤组织中的表达
        3.3.3 骨肉瘤组织中ROCK2与PFKFB3 表达的相关性
        3.3.4 改变骨肉瘤细胞中ROCK2 表达后,PFKFB3 的表达情况
        3.3.5 PFKFB3是ROCK2 介导的骨肉瘤细胞生长及转移的关键分子
    3.4 讨论
    3.5 结论
第4章 ROCK2 抑制PFKFB3 泛素化进而稳定其表达
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 细胞培养
        4.2.3 Western blot实验方法
        4.2.4 质粒构建
        4.2.5 免疫共沉淀(Co-IP)
    4.3 结果
        4.3.1 PFKFB3 基因在骨肉瘤细胞中通过泛素-蛋白酶体系统降解
        4.3.2 ROCK2 抑制骨肉瘤细胞PFKFB3 泛素化降解
    4.4 讨论
    4.5 结论
全文总结
参考文献
攻读学位期间研究成果
致谢
综述
    参考文献



本文编号：4050528