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CircFAT1吸附miR-375从而增加骨肉瘤细胞中YAP1蛋白表达机制研究

发布时间:2025-08-12 21:59
  目的目前迫切需要寻找确定治疗骨肉瘤的新分子靶标。环状RNA是一类内源性RNA,广泛存在于哺乳动物细胞中,并在调节基因表达中发挥关键作用,但在骨肉瘤中,环状RNA的潜在分子机制仍知之甚少。在这里,我们评估了骨肉瘤中环状RNA circFAT1的在骨肉瘤发生发展中的功能及特性。方法首先体外实验明确circFAT1在骨肉瘤中环状RNA的特性,评估circFAT1/miR-375/YAP1对人骨肉瘤细胞生长,凋亡,迁移,侵袭和肿瘤发生的影响。通过蛋白质印迹,荧光定量链式扩增反应,荧光原位杂交,显色原位杂交,RNA结合蛋白免疫沉淀和免疫荧光分析相关信号通路以及circFAT1与miR-375结合模式、功能及具体结合位点。在携带143B骨肉瘤细胞异种移植物的肿瘤生长小鼠中评估了circFAT1及miR-375在骨肉瘤发生发展过程中的功能及作用,以及两者之间具体的结合模式。结果在这项研究中,我们观察到人骨肉瘤组织和细胞系中FAT1基因外显子2产生的circFAT1明显上调。降低骨肉瘤细胞中circFAT1有效地阻止了骨肉瘤细胞的迁移,侵袭和肿瘤发生,并在体内抑制了骨肉瘤的生长。我们观察到人骨肉瘤组织和...

【文章页数】:125 页

【学位级别】:博士

【部分图文】:

图1.1 circFAT1在骨肉瘤组织及细胞中表达显著增高

图1.1 circFAT1在骨肉瘤组织及细胞中表达显著增高

为了研究circFAT1在骨肉瘤发育中的功能,我们检测了circFAT1在12对软骨瘤和骨肉瘤组织以及骨肉瘤细胞系中的表达水平。通过使用逆转录聚合酶链反应(RT–PCR)和显色原位杂交(CISH),我们发现circFAT1在OS组织和细胞系中上调(图1.1)。3.2circFA....


图1.2 circFAT1在骨肉瘤细胞系中的特征

图1.2 circFAT1在骨肉瘤细胞系中的特征

然后,我们通过Sanger测序证实了circFAT1RT-PCR产物从头到尾的剪接以及cir-cFAT1的大小(图1.2d)。但是,可以通过转拼或基因组重排产生头尾拼接。因此,我们排除了这些可能性。首先,我们设计了收敛引物来扩增FAT1mRNA,并设计了不同引物来扩增cir....


图1.3 circFAT1在骨肉瘤细胞系中的功能

图1.3 circFAT1在骨肉瘤细胞系中的功能

为了探索circFAT1在OS细胞中的功能,我们将circFAT1小发夹RNA(shRNA)构建体转染到143B和HOS细胞中。该转染靶向circFAT1的连接位点,并建立了稳定的敲低细胞。在这些细胞中,circFAT1的表达显着降低(图1.3a)。相反,FAT1mRNA的表达....


图2.1 CircFAT1充当骨肉瘤细胞中miR-375的海绵。

图2.1 CircFAT1充当骨肉瘤细胞中miR-375的海绵。

由于circFAT1在细胞质中丰富且稳定,因此我们对在线AGO2免疫沉淀数据进行了分析,其中包括来自doRiNA的高通量测序。结果表明,在circFAT1区域中AGO2的占有率很高,在整个脊椎动物物种中高度保守(图2.1a)。为了验证这一结果,我们对HOS细胞中AGO2进行了RN....



本文编号:4059193

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