人COX1蛋白真核表达载体的构建及其生物信息学分析

发布时间：2025-05-05 01:16

　　 目的:构建表达重组环氧合酶1 （COX1）真核表达载体,验证其体外能够催化底物合成前列腺素E1 （PGE1）,以寻找高效获得PGE1的方法。方法:提取人微血管内皮细胞（HMECs）总RNA,逆转录成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增人COX1基因,经双酶切后与真核表达载体pCMV6连接,构建重组pCMV6-COX1真核表达质粒。通过生物信息学在线工具分析COX1蛋白的疏水性、跨膜区域、信号肽、二级结构和三级结构。采用脂质体将重组质粒转染至HEK-293F细胞中,将细胞随机分为对照组（未转染重组质粒的HEK-293F细胞）、转染重组质粒2d组和转染重组质粒5d组,分别收集细胞和细胞培养上清,Western blotting法检测COX1蛋白表达水平。比较真核表达的COX1蛋白与羊精囊提取法制备的粗酶混合物催化底物二高-γ-亚麻酸合成PGE1的酶活性。结果:经PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建pCMV6-COX1重组载体,目的基因长度约为1 800bp。生物信息学分析,COX1蛋白为水溶性蛋白,1～53位氨基酸为信号肽,34～53位氨基酸处于跨膜区域,有36个丝氨酸磷酸化位点、14个苏...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞、主要试剂和仪器
    1.2 PCR扩增目的基因COX1
    1.3 重组真核表达载体pCMV6-COX1的构建
    1.4 COX1重组真核表达质粒的鉴定
    1.5 COX1蛋白生物信息学分析
    1.6 COX1基因真核表达载体转染HEK-293F细胞
    1.7 羊精囊提取粗酶混合物
    1.8 COX1酶催化二高-γ-亚麻酸合成PGE1含量的测定
    1.9 统计学分析
2 结果
    2.1 PCR扩增目的基因COX1
    2.2 COX1基因真核表达载体的鉴定
    2.3 COX1蛋白生物信息学分析
    2.4 Western blotting法检测HEK-293F细胞和细胞培养上清中COX1蛋白表达水平
    2.5 真核表达COX1蛋白和羊精囊提取粗酶催化底物合成PGE的含量
3 讨论



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