程序性细胞死亡配体1胞外区原核重组表达、纯化及其多克隆抗体制备

发布时间：2025-06-24 05:40

　　 为制备程序性细胞死亡配体1胞外区多肽及其鼠源性多克隆抗体,根据UniProtKB数据库中公布的其胞外区基因序列(标识符:Q9NZQ7-1)和原核表达载体pET-28a(+)Nde I上游和Xho I位点下游的序列,设计合成带有同源臂的特异性引物.以合成的PD-L1胞外区基因为模板,PCR扩增程序性细胞死亡配体1胞外区基因并将其克隆至pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E,转化至大肠杆菌DH5α中,扩增并提取其质粒,然后将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达.亲和层析镍柱纯化重组蛋白后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,确认表达蛋白正确.浓缩换液后用重组蛋白免疫Balb/c品系小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测,成功获得抗程序性细胞死亡配体1胞外区血清.该研究对于研发某些肿瘤伴随诊断检测试剂有重要意义.

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材 料
    1.2 主要试剂
    1.3 方 法
        1.3.1 PD-L1胞外区(PD-L1-E)基因合成、引物设计与合成
        1.3.2 PD-L1-E扩增、检测及胶回收
        1.3.3 重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E构建
        1.3.4 pET-28a(+)-PD-L1-E重组质粒转化、His-PD-L1-E重组蛋白预表达及鉴定
        1.3.5 His-PD-L1-E重组蛋白大量表达、纯化及鉴定
        1.3.6 His-PD-L1-E重组蛋白质谱鉴定
        1.3.7 小鼠多克隆抗体制备及检测
2 结 果
    2.1 PD-L1-E 基因的扩增、重组表达载体的构建及鉴定
    2.2 pET-28a(+)-PD-L1-E重组质粒转化、表达、纯化及鉴定
    2.3 His-PD-L1-E重组蛋白质谱鉴定
    2.4 小鼠多克隆抗体制备效果鉴定
3 讨 论



本文编号：4052570