ROS1基因对胃癌细胞生物学行为的影响及其分子机制的研究

发布时间：2025-05-11 03:49

　　目的:在全世界范围内,胃癌发病率占恶性肿瘤总发病率的第4位,而死亡率却排在第3位的常见的恶性肿瘤之一。我国是胃癌大国,东南沿海地区是胃癌的高发地区。所以胃癌是严重影响我国国民健康的重大疾病。由于缺乏特异性症状,临床上很难早期发现,临床Ⅲ期、Ⅳ期患者占大多数。目前胃癌内科治疗手段有限,能进行根治性手术的患者比例小,化疗疗效欠佳,靶向治疗也只有曲妥珠单抗和阿帕替尼取得了肯定的临床疗效,但适用人群有限,还存在着治疗耐药问题。当今肿瘤治疗已进入精准医疗时代,需要找到新的治疗靶点,开发新的治疗药物。ROS1是一种是单体型受体酪氨酸激酶,广泛表达于人体肾、小脑、胃肠等多种组织。目前的研究发现在肺癌、卵巢癌、肉瘤、胆管细胞癌和炎性肌纤维母细胞瘤等组织中以基因重排方式激活,是一种癌基因。近年在非小细胞肺癌的临床研究中找到了针对ROS1基因重排的治疗药物克唑替尼。使这一基因成为恶性肿瘤精准治疗研究的重要靶点。已有国内外学者在胃癌临床组织标本中用FISH方法检测到ROS1基因重排,且确定ROS1基因重排与差的临床表型如低分化、淋巴结转移相关。因此虽然ROS1基因重排在胃癌中检出率不高,但已经开发出确定有效的...

【文章页数】：135 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 :ROS1基因稳定沉默胃癌细胞株的建立
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验细胞
            2.1.2 质粒
            2.1.3 PCR引物
            2.1.4 主要实验仪器
            2.1.5 主要实验试剂
            2.1.6 主要溶液的配置
        2.2 实验方法
            2.2.1 胃癌细胞培养
            2.2.2 RNA干扰质粒的构建
            2.2.3 ROS1 基因稳定沉默胃癌细胞的筛选和培养
            2.2.4 Western blot鉴定胃癌细胞ROS1 蛋白的表达
            2.2.5 Real-time PCR方法鉴定ROS1 基因敲减效率
        2.3 统计分析
    3 结果
        3.1 ROS1 基因在胃癌细胞中的蛋白表达
        3.2 成功建立ROS1 基因稳定沉默的胃癌细胞株
            3.2.1 质粒构建及测序验证
            3.2.2 ROS1 基因稳定沉默胃癌细胞株的建立
        3.3 ROS1 基因敲减效率测定
            3.3.1 应用Real-time PCR方法检测ROS1 基因敲减后胃癌细胞ROS1 mRNA表达减低
            3.3.2 应用Western Blot方法检测ROS1 基因敲减后胃癌细胞ROS1 蛋白表达降低
    4 讨论
    5 结论
第二部分 :ROS1基因对胃癌细胞生物学行为的影响
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 胃癌细胞
            2.1.2 主要仪器
            2.1.3 主要试剂
            2.1.4 主要溶液配制
        2.2 实验方法
            2.2.1 MTT法测定各组细胞生长曲线
            2.2.2 克隆形成实验检测胃癌细胞成瘤能力
            2.2.3 流式细胞仪检测细胞周期
            2.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡
            2.2.5 细胞划痕愈合实验检测胃癌细胞迁移能力
            2.2.6 Transwell小室侵袭实验观察胃癌细胞侵袭能力
        2.3 统计分析
    3 结果
        3.1 ROS1 基因沉默后胃癌细胞生长速度减慢
        3.2 ROS1 基因沉默后胃癌细胞克隆形成数量减少
        3.3 ROS1 基因沉默后细胞周期G1 期比例升高,S/G2 期比例下降
        3.4 ROS1 基因沉默后胃癌细胞凋亡比例增高
        3.5 ROS1 基因沉默后胃癌细胞划痕愈合率减慢
        3.6 ROS1 基因沉默后胃癌细胞穿过小室微孔膜数量减少
    4 讨论
    5 结论
第三部分 :ROS1基因影响胃癌细胞生物学行为的分子机制
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 胃癌细胞株
            2.1.2 PCR引物
            2.1.3 主要实验仪器
            2.1.4 主要试剂
            2.1.5 主要溶液配制
        2.2 实验方法
            2.2.1 Western blot方法检测各组胃癌细胞中凋亡相关蛋白
            2.2.2 Western blot方法检测细胞粘附蛋白及细胞骨架蛋白表达
            2.2.3 Western blot方法检测胃癌细胞中信号传导通路蛋白表达
            2.2.4 Real-time PCR方法检测胃癌细胞调控上皮间质转化相关转录因子
            2.2.5 Real-time PCR方法检测胃癌细胞转移相关基因MMP9 表达情况
        2.3 统计分析
    3 结果
        3.1 ROS1 基因沉默后胃癌细胞凋亡相关因子变化
        3.2 ROS1 基因沉默后细胞粘附蛋白及细胞骨架蛋白的变化
        3.3 ROS1 基因沉默后胃癌细胞信号传导通路蛋白变化
        3.4 ROS1 基因沉默后胃癌细胞上皮间质转化相关转录因子Twist,Snail,Slug表达下降
        3.5 ROS1 基因沉默后胃癌细胞MMP9 基因表达下降
    4 讨论
    5 结论
第四部分 :ROS1在胃癌组织中过表达且与胃癌不良预后相关
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 TCGA数据库中胃癌组织中ROS1 mRNA的表达与临床病理因素及患者预后的关系以及ROS1 基因扩增情况
            2.1.2 组织标本
            2.1.3 主要仪器
            2.1.4 主要试剂
            2.1.5 主要试剂溶液配置
        2.2 实验方法
            2.2.1 qRT-PCR法检测ROS1 mRNA在37 例胃癌及其配对正常胃粘膜组织中的表达
            2.2.2 免疫组织化学染色检测胃癌组织中ROS1 蛋白表达
    3 结果
        3.1 TCGA数据库ROS1 mRNA在胃癌组织中高表达
        3.2 TCGA数据库ROS1 mRNA表达与胃癌临床病理特征的关系及意义
        3.3 ROS1 mRNA表达与胃癌总生存率的关系
        3.4 TCGA数据中ROS1 基因扩增
        3.5 qRT-PCR方法检测ROS1 mRNA在37 例胃癌组织中高表达
        3.6 免疫组织化学染色检测ROS1 蛋白在胃癌及正常胃粘膜组织中的表达
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：4044798