基于环介导等温扩增方法高效检测模拟眼内液中铜绿假单胞菌的研究

发布时间：2025-06-24 00:36

　　 目的建立一个稳定、高效检测眼内液中铜绿假单胞菌的体系。方法采用环介导等温扩增(LAMP)技术,由0.1～0.2 mL眼内平衡盐溶液(BSS)模拟眼内房水或玻璃体,利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计5组LAMP引物,并对扩增方法进行关键试剂的优化,检测眼内液中铜绿假单胞菌。结果该扩增方法经过优化后,最低可以检出100 fg/μL纯基因组DNA,接近荧光定量灵敏度,具有很好的重现性。此外该方法在检测眼内液中混合的菌落时呈现出良好的检测效果,可以检测出2.1×10～2 CFU/mL,极具应用价值。结论建立了一个稳定、高效、灵敏的恒温扩增体系,可以应用于眼内液中铜绿假单胞菌的检测。

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

图1 铜绿假单胞菌的扩增引物筛选。

如图1所示,从5组引物中最终筛选出第3组引物,其阴性扩增不出峰,阳性反应出峰时间在30min之前。将其和常见5种眼内炎微生物进行交叉扩增,没有出峰,最终确定该组引物可用于后续的灵敏度检测和眼内液中铜绿假单胞菌检测。2.2实时LAMP体系

图2 铜绿假单胞菌LAMP体系优化

镁离子的浓度和Bst酶的活性有着很高的相关性,最适合的镁离子浓度是高效反应的关键。在具体的优化实验中,首先按照标准体系对额外的镁离子浓度为基准进行优化,分别在对应核酸的阴性扩增反应和阳性扩增反应中加入0.1mol/L硫酸镁0、1、2、3μL,比较其差别,结果见图2。由图见额外....

图3 铜绿假单胞菌的LAMP检测灵敏度

将铜绿假单胞菌的基因组DNA以优化扩增条件时的核酸浓度向下稀释108倍,结果见图3。从图中可以看出,优化后的LAMP体系(10×ThermoPolReactionBuffer2.5μL,10mmol/LdNTPs3.5μL,引物Mix1μL,0.1mol/....

图4 实时qPCR灵敏度

对铜绿假单胞菌核酸稀释实验,可以发现LAMP方法在铜绿假单胞检测体系的检测限大约是100fg/μL。为了验证该扩增方法的准确性,我们选择通用的实时qPCR法对上述9个浓度梯度的核酸进行检测,结果如图4,实时qPCR法可以检测1fg/μL。2.5灌注液中铜绿假单胞菌的灵敏度检....

本文编号：4052234