牙鲆（Paralichthys olivaceus）胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）基因的克隆和表达调控分析

发布时间：2025-05-07 01:24

　　在鱼类和其它脊椎动物中，胰岛素样生长因子（IGF）信号系统对于机体的生长、代谢和繁殖有着非常重要的作用。该信号系统由两个配体（IGF-I，IGF-II）、两个受体（IGF-IR、IGF-IIR）和六个IGF结合蛋白（IGFBP1-6）组成。其中，IGFBPs不仅有依赖IGFs的作用，如调控IGFs的生物利用率、刺激或抑制IGFs的生物活性，还有不依赖IGFs的独立作用，可以通过结合细胞表面受体或直接进入细胞核调控细胞的生长和分化。在本研究中，我们首先从健康牙鲆肝脏组织中克隆得到了牙鲆IGFBP-2a、-2b、-3和-4基因序列并进行分析；利用荧光定量PCR技术分析了牙鲆四种IGFBPs基因的在成体组织中的分布和在不同发育时期的胚胎和仔鱼中的表达差异；利用原代培养的牙鲆肝脏组织细胞研究了不同激素对牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因的表达调控作用；最后克隆得到牙鲆四种IGFBPs基因的启动子序列并进行了生物信息学分析。本研究的主要结果如下： （1）本研究克隆得到了牙鲆两个IGFBP-2基因。其中IGFBP-2a基因cDNA长1186bp，由42bp长的5’UTR、861bp长的ORF...

【文章页数】：154 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 胰岛素样生长化因子信号系统
        1.1 IGF 配体
        1.2 IGF 受体
        1.3 IGF 结合蛋白
        1.4 IGFs 信号系统对生长发育的作用
    2 胰岛素样生长因子结合蛋白
        2.1 六种 IGFBPs
        2.2 IGFBPs 的结构
        2.3 IGFBPs 对 IGFs 的调控作用
        2.4 IGFBPs 不依赖 IGFs 的作用
    3 IGFBP 在鱼类中的研究
        3.1 鱼类 IGFBPs 的发现
        3.2 鱼类 IGFBPs 的克隆
        3.3 鱼类 IGFBP 的表达和调控
    4 本实验的目的和意义
第二章 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的克隆和表达分析
    1 材料和方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 不同成体组织的取材
            1.1.3 不同发育时期样品的取材
        1.2 实验所用引物
        1.3 总 RNA 的提取及纯化
            1.3.1 总 RNA 的提取
            1.3.2 总 RNA 的纯化
        1.4 牙鲆 cDNA 第一条链的合成
        1.5 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因核心片段的获得
            1.5.1 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因核心片段的克隆
            1.5.2 连接反应
            1.5.3 转化与筛选
        1.6 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因全长 cDNA 序列的获得
            1.6.1 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因 3’UTR 的获得
            1.6.2 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因 5’UTR 的获得
            1.6.3 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因 cDNA 序列的获得
        1.7 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因序列分析
        1.8 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的组织分布和时序表达分析
            1.8.1 模板 cDNA 的合成
            1.8.2 实时荧光定量 PCR
            1.8.3 数据处理
    2 结果
        2.1 牙鲆总 RNA 的提取
        2.2 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因核心序列的克隆
        2.3 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因 cDNA 序列的获得和分析
        2.4 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的蛋白结构和聚类分析
            2.4.1 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的蛋白结构预测和分析
            2.4.2 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的系统进化分析
        2.5 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的组织分布和时序表达
            2.5.1 牙鲆 IGFBP-2a 基因的组织分布和时序表达分析
            2.5.2 牙鲆 IGFBP-2b 基因的组织分布和时序表达分析
    讨论
第三章 牙鲆 IGFBP-3 基因的克隆和表达分析
    1 材料和方法
        1.1 实验材料
        1.2 实验所用引物
        1.3 总 RNA 的提取及纯化
        1.4 牙鲆 cDNA 第一条链的合成
        1.5 牙鲆 IGFBP-3 基因核心片段的获得
        1.6 牙鲆 IGFBP-3 基因全长 cDNA 序列的获得
        1.7 牙鲆 IGFBP-3 基因组序列的获得
            1.7.1 牙鲆基因组 DNA 的提取
            1.7.2 牙鲆 IGFBP-3 基因全长序列的获得
        1.8 牙鲆 IGFBP-3 基因序列分析
        1.9 牙鲆 IGFBP-3 基因的组织分布和时序表达分析
    2 结果
        2.1 牙鲆 IGFBP-3 基因 cDNA 序列的克隆和分析
        2.2 牙鲆 IGFBP-3 基因序列克隆和分析
        2.3 牙鲆 IGFBP-3 基因的蛋白结构和聚类分析
            2.3.1 牙鲆 IGFBP-3 基因的蛋白结构预测和分析
            2.3.2 牙鲆 IGFBP-3 基因的系统进化分析
        2.4 牙鲆 IGFBP-3 基因的组织分布和时序表达
            2.4.1 牙鲆 IGFBP-3 基因在成体组织中的表达
            2.4.2 牙鲆 IGFBP-3 基因在不同发育时期的胚胎和仔鱼中的表达
    讨论
第四章 牙鲆 IGFBP-4 基因的克隆、表达分析和原核表达
    第一节 牙鲆 IGFBP-4 基因的克隆和表达分析
        1 材料和方法
            1.1 实验材料
            1.2 实验所用引物
            1.3 总 RNA 的提取及纯化
            1.4 牙鲆 cDNA 第一条链的合成
            1.5 牙鲆 IGFBP-4 基因核心片段的获得
            1.6 牙鲆 IGFBP-4 基因全长 cDNA 序列的获得
            1.7 牙鲆 IGFBP-4 基因组序列的获得
            1.8 牙鲆 IGFBP-4 基因序列分析
            1.9 牙鲆 IGFBP-4 基因的组织分布和时序表达分析
        2 结果
            2.1 牙鲆 IGFBP-4 基因 cDNA 序列的克隆和分析
            2.2 牙鲆 IGFBP-4 基因序列克隆和分析
            2.3 牙鲆 IGFBP-4 基因的蛋白结构和聚类分析
                2.3.1 牙鲆 IGFBP-4 基因的蛋白结构预测和分析
                2.3.2 牙鲆 IGFBP-4 基因的系统进化分析
            2.4 牙鲆 IGFBP-4 基因的组织分布和时序表达
                2.4.1 牙鲆 IGFBP-4 基因在成体组织中的表达
                2.4.2 牙鲆 IGFBP-4 基因在不同发育时期的胚胎和仔鱼中的表达
    第二节 牙鲆 IGFBP-4 的原核表达及产物纯化
        1 材料和方法
            1.1 实验材料和试剂
            1.2 目的片段的扩增
            1.3 重组质粒的构建
                1.3.1 质粒提取
                1.3.3 重组质粒的构建
            1.4 重组菌株诱导条件的优化
                1.4.1 重组菌株的活化和表达诱导
                1.4.2 SDS-PAGE
                1.4.3 诱导时间和温度优化
            1.5 重组蛋白的可溶性分析和纯化
        2 结果
            2.1 牙鲆 IGFBP-4 成熟肽片段的获得
            2.2 重组质粒的构建
            2.3 重组蛋白诱导时间和温度优化
                2.3.1 重组蛋白诱导时间的优化
                2.3.2 重组蛋白培养温度的优化
            2.4 重组蛋白的可溶性分析和纯化
    讨论
第五章 激素对牙鲆 IGFBP-3 和-4 基因的体外表达调控
    1 材料和方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 实验试剂
            1.1.3 溶液配制
        1.2 牙鲆肝细胞的分离
        1.3 台盼蓝染色和细胞计数
            1.3.1 台盼蓝染色
            1.3.2 肝细胞计数
        1.4 牙鲆肝细胞原代培养系统的建立
        1.5 不同激素对牙鲆肝细胞的刺激
            1.5.1 GH 对牙鲆 IGFBP-3 和 IGFBP-4 的剂量和时间效应
            1.5.2 胰岛素对牙鲆 IGFBP-3 和 IGFBP-4 的剂量和时间效应
            1.5.3 IGF-I 对牙鲆 IGFBP-3 和 IGFBP-4 的剂量和时间效应
            1.5.4 IGF-II 对牙鲆 IGFBP-3 和 IGFBP-4 的剂量和时间效应
        1.6 不同激素对 IGFBP-3 和 IGFBP-4 在牙鲆肝细胞中的表达分析
    2 结果
        2.1 牙鲆肝脏组织细胞的分离
        2.2 原代培养细胞总 RNA 的提取
        2.3 激素对牙鲆肝细胞 IGFBP-3 的表达调控
            2.3.1 GH 对牙鲆肝细胞 IGFBP-3 的表达调控
            2.3.2 胰岛素对牙鲆肝细胞 IGFBP-3 的表达调控
            2.3.3 IGF-I 对牙鲆肝细胞 IGFBP-3 的表达调控
            2.3.4 IGF-II 对牙鲆肝细胞 IGFBP-3 的表达调控
        2.4 激素对牙鲆肝细胞 IGFBP-4 的表达调控
            2.4.1 GH 对牙鲆肝细胞 IGFBP-4 的表达调控
            2.4.2 胰岛素对牙鲆肝细胞 IGFBP-4 的表达调控
            2.4.3 IGF-I 对牙鲆肝细胞 IGFBP-4 的表达调控
            2.4.4 IGF-II 对牙鲆肝细胞 IGFBP-4 的表达调控
    讨论
第六章 牙鲆 IGFBPs 基因启动子的克隆及序列分析
    1 材料和方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 实验试剂
        1.2 实验所用引物
        1.3 牙鲆基因组 DNA 的提取
        1.4 染色体步移
        1.5 牙鲆四种 IGFBP 基因启动子序列的获得
            1.5.1 引物设计
            1.5.2 牙鲆 IGFBP-4 基因启动子序列的克隆
        1.6 牙鲆四种 IGFBP 基因启动子序列的生物信息学分析
    2. 结果
        2.1 牙鲆四种 IGFBP 基因启动子序列的获得
        2.2 牙鲆四种 IGFBP 基因启动子序列的生物信息学分析
    讨论
参考文献
个人简历
发表的学术论文
致谢



本文编号：4043387