大黄鱼与美国红鱼抗菌肽Piscidin串联基因的构建、酵母表达及抗菌活性鉴定

发布时间：2025-05-05 02:53

　　 采用Piscidin基因串联表达的方案,通过Eco31Ⅰ限制性内切酶定向连接方法合成Pseudosciaena crocea-Sciaenops ocellatus-piscidin (PSP)串联基因.以毕赤酵母(Pichia pastoris)的穿梭表达载体pPICZαA构建重组表达质粒pPICZαA-PSP,转化入毕赤酵母SMD1168菌株中.应用实时荧光定量PCR方法进行多拷贝克隆筛选,实现了PSP重组串联肽的诱导表达和纯化,并对其抑菌活性进行初步鉴定,为piscidin抗菌肽的生产应用奠定基础.

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【部分图文】：

图1 PSP串联基因设计

P.crocea-S.ocellatus-piscidin(PSP）串联基因设计如图1所示：由2个PC-piscidin基因、2个SO-piscidin基因和3个连接肽基因（linkergene，序列为5′-GGTTCTCCAGGTTCCGGT-3′）组成；串联基因3′-端添加....

图2 pPICZαA-PSP质粒PCR检测（a）与双酶切验证（b)

使用5′-AOX和3′-AOX引物对重组质粒进行PCR检测，获得约800bp的目的扩增条带（图2(a））；再使用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切处理pPICZαA-PSP质粒，如图2(b）所示，可得358bp的目的片段与3500bp的载体条带，证实插入表达载体的片段与设计合成基因一致．....

图3 阳性克隆筛选

pPICZαA-PSP及pPICZαA质粒经SacⅠ线性化后，电转化入SMD1168菌株，使用5′-AOX、3′-AOX、PC1、SO8引物交替组合进行PCR，筛选阳性克隆．图3结果显示各条带大小均符合设计理论值，表明目的片段已正确整合进酵母基因组中．2.3多拷贝重组菌株的筛选

图4 GAP基因和PSP串联基因的标准曲线

GAP基因和PSP串联基因的标准曲线及回归方程见图4．将实验所得各阳性菌株的Ct值分别代入标准曲线回归方程中，求出所检测的DNA样品中PSP串联基因拷贝数与GAP基因拷贝数，两者比值即为PSP串联基因在酵母基因组中的拷贝数，结果显示第12号菌株在基因组中存在5个拷贝的PSP基因（....

本文编号：4043012