CRISPR/Cas9介导的自发性高胆固醇血症兔模型的建立

发布时间：2025-06-21 04:20

　　目的:为了研究自发性高胆固醇血症和动脉粥样硬化性疾病,针对兔LDLR和ApoE基因,使用CRISPR/Cas9基因编辑工具制备低密度脂蛋白受体(LDL receptor,LDLR)和/或载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因缺失的自发性高胆固醇血症兔模型。方法:本研究使用CRISPR/Cas9系统,分别针对兔LDLR基因第2外显子设计1对sgRNA(sgRNA1、sgRNA2)和第7外显子设计1对sgRNA(sgRNA3、sgRNA4),以及针对ApoE基因第1外显子设计1对sgRNA(sgRNA5、sgRNA6)。将经过体外转录获得的Cas9 mRNA和不同的sgRNA分组显微注射至不同受精卵的细胞质内,分组如下:①Cas9mRNA和 sgRNA1、sgRNA3、sgRNA6;②Cas9mRNA 和 sgRNA2、sgRNA4、sgRNA5;③Cas9mRNA和sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4;④Cas9mRNA和sgRNA5、sgRNA6。将注射好的受精卵胚胎移植至受体中,代孕,获得原代兔。对原代兔进行基因型鉴定、编码氨基酸和蛋白结构模拟分...

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
总体研究方案和创新点
符号说明
前言
第一章 Cas9 mRNA和sgRNA的准备
    1. 实验材料
        1.1 主要实验器材
        1.2 主要试剂药品
        1.3 常用试剂的配制
    2. 实验方法
        2.1 兔LDLR和ApoE基因的检索
        2.2 兔LDLR和ApoE基因修饰位点的筛选和sgRNA的设计
        2.3 CRISPR/Cas9二合一质粒构建及鉴定
        2.4 体外转录为mRNA
    3. 实验结果
        3.1 LDLR和ApoE基因修饰位点的设计
        3.2 sgRNA的寡核苷酸链引物的设计
        3.3 CRISPR/Cas9二合一质粒构建及鉴定
    总结和计划
第二章 利用多sgRNA靶向敲除兔LDLR和/或ApoE基因
    1. 实验材料
        1.1 主要实验器材
        1.2 主要试剂药品
        1.3 实验动物
        1.4 常用试剂的配制
    2. 实验方法
        2.1 供受体的准备
        2.2 收集供体兔的受精卵
        2.3 sgRNAs和Cas9mRNA显微注射至受精卵
        2.4 胚胎移植
        2.5 胚胎移植后受体兔孕期与分娩护理
        2.6 原代兔的基因鉴定
        2.7 脱靶位点的预测与检测
        2.8 突变兔的表型检测
    3. 实验结果
        3.1 原代兔PCR结果
        3.2 突变兔的基因型
        3.3 脱靶分析
        3.4 突变兔的血脂浓度检测
        3.5 突变兔的血浆载脂蛋白分析
        3.6 突变兔的血浆脂蛋白类型分析
        3.7 动脉粥样硬化组织病理分析
    小结和计划
第三章 第7外显子突变的自发性高胆固醇血症LDLR-/-兔模型的制备
    1. 实验材料
    2. 实验方法
        2.1 sgRNA和Cas9mRNA显微注射至受精卵
        2.2 蛋白结构预测
        2.3 突变兔血浆FPLC分析
        2.4 血浆炎性介质(IL-1β、IL-6、CCL2)的测定和血浆白细胞计数
        2.5 Masson三色染色
    3. 实验结果
        3.1 突变兔的基因型
        3.2 突变兔的编码氨基酸
        3.3 蛋白结构模拟
        3.4 血脂检测
        3.5 血浆炎症因子检测
        3.6 血浆白细胞计数
        3.7 血浆载脂蛋白和脂蛋白的分析
        3.8 动脉粥样硬化分析
    小结
第四章 ApoE^-/-兔模型的制备
    1. 实验材料
    2. 实验方法
    3. 实验结果
        3.1 突变兔基因型
        3.2 蛋白结构分析
        3.3 血浆ApoE蛋白检测
        3.4 血脂含量检测
        3.5 子代兔的检测
    小结
全文讨论
全文总结
综述
    1. 高胆固醇血症的研究进展
    2. 与高胆固醇血症有关的基因
        2.1 低密度脂蛋白受体(LDLR)
        2.2 前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PSCK-9)
        2.3 载脂蛋白B (ApoB)
        2.4 载脂蛋白E (ApoE)
        2.5 LDLR衔接蛋白1 (LDLRAP1)
        2.6 小结
    3. 高胆固醇血症的治疗进展与前景
        3.1 药物治疗
        3.2 基因治疗
    4. 动脉粥样硬化(AS)的研究现状
        4.1 发病机制
        4.2 诊断治疗
    5. 动脉粥样硬化动物模型的选择
    6. CRISPR/Cas9系统的前景与挑战
参考文献
攻读学位期间发表论文及科研情况
致谢



本文编号：4051905