基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性基因编码ROS细胞传感器

发布时间：2025-06-21 01:13

　　机体在遭受到有害刺激时,细胞中会呈现氧化应激反应,而体内的活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)就是其中一个重要指标,当自由基水平超标,机体自身抗氧化清除能力不足,使得氧化-抗氧化系统失衡,进而造成机体氧化损伤[1]。因此,实时动态检测活细胞内ROS变化显得尤为重要。目前,检测活细胞中ROS水平的方法有外源性和内源性两大方法体系,其中内源性探针有细胞毒性小、生物相容性好等优势,是目前ROS检测的发展趋势。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Epoxy Chloropropane Kelch Sample related Protein-1,Keapl)/核因子 E2 相关因子 2(Nuclear Factor Erythroid-2 related Factor 2,Nrf2)-抗氧化元件(Antioxidant Response Element,ARE)这样一条机体内内源性抗氧化信号通路[2]可以改造后作为内源性检测ROS的一条新的途径。当机体内ROS水平处于生理状态时,Keapl蛋白质介导Nrf2蛋白质泛素化降解;当机体受到外界刺激导致ROS水平升高时,N...

【文章页数】：153 页

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摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
    1.1 活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)
    1.2 ROS检测的重要意义
    1.3 ROS的检测手段
        1.3.1 roGFP(Reduction-oxidation-sensitive Green Fluorescent Protein)家族
        1.3.2 rxYFP家族
        1.3.3 Redoxfluor (Genetically Encoded Fluorescence Resonance Energy TransferProbe)
        1.3.4 cpYFP
        1.3.5 Hyper系列内源性细胞传感器
        1.3.6 Redox特异敏感型的量子点探针
        1.3.7 常见的外源性ROS检测探针
    1.4 基因编码内源性细胞传感器的应用以及优势
    1.5 293T细胞中ROS检测的重要意义
    1.6 ROS是白血病检测的细胞水平标志物
    1.7 Keap1/Nrf2-ARE信号通路
        1.7.1 Keap1蛋白质(Epoxy Chloropropane Kelch Sample related Protein-1, Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1)
        1.7.2 Nrf2(Nuclear Factor Erythroid-2 related Factor 2,核因子E2相关因子2)
        1.7.3 ARE(Antioxidant Response Element,抗氧化反应元件)
        1.7.4 Keap1/Nrf2-ARE信号通路的反应机制
    1.8 课题研究内容以及选题意义
        1.8.1 课题主要研究内容
        1.8.2 研究成果及创新点
            1.8.2.1 主要研究成果
            1.8.2.2 创新点
第二章 基于Keap1/NRF2-ARE信号通路的内源性基因编码ROS细胞传感器的构建
    2.1 引言
    2.2 内源性基因编码ROS细胞传感器的设计
    2.3 实验材料及仪器
        2.3.1 实验试剂与材料
        2.3.2 实验仪器与设备
    2.4 元件序列
    2.5 实验方法
        2.5.1 pLVX-5XARE-hCMVmp-mCherry-Puro质粒构建
            2.5.1.1 Oligo退火合成制备5XARE和hCMVmp片段
            2.5.1.2 pLVX-mCherry-T2A-Puro载体骨架制备
            2.5.1.3 目标片段与载体骨架连接构建重组质粒
            2.5.1.4 转化
            2.5.1.5 挑选单克隆菌落并且进行PCR验证以及测序
        2.5.2 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro质粒构建
            2.5.2.1 Hela细胞(人源)的总RNA提取
            2.5.2.2 基因组DNA的去除和cDNA的合成
            2.5.2.3 设计引物并且从cDNA模板上运用PCR手段获取Keap1和Nrf2基因片段
            2.5.2.4 EGFP片段的获取
            2.5.2.5 pLVX-T2A-EGFP-Puro质粒构建
            2.5.2.6 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-Puro质粒构建
            2.5.2.7 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro质粒构建
        2.5.3 pLVX-5XARE-hCMVmp-mNeonGreen-Puro质粒构建
            2.5.3.1 含mNeonGreen基因的大肠杆菌复苏
            2.5.3.2 mNeonGreen的PCR引物设计
            2.5.3.3 mNeonGreen基因片段PCR
            2.5.3.4 mNeonGreen基因片段Cycle-Puro
            2.5.3.5 mNeonGreen基因片段和pLVX-5XARE-hCMVmp-mCherry-Puro载体的酶切
            2.5.3.6 胶回收、连接、转化、测序和提取去内毒素质粒
        2.5.4 pLVX-Keap1-T2A- mCherry-T2A-Nrf2-Puro质粒构建
            2.5.4.1 mCherry基因的PCR引物设计
            2.5.4.2 mCherry基因片段PCR
            2.5.4.3 mCherry基因片段Cycle-Puro
            2.5.4.4 mCherry基因片段和pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro载体的酶切
            2.5.4.5 胶回收、连接、转化、测序和提取去内毒素质粒
        2.5.5 潮霉素(HygR)替代嘌呤霉素(Puro)
            2.5.5.1 HygR基因片段的PCR引物设计
            2.5.5.2 HygR的片段PCR
            2.5.5.3 HygR基因片段进行Cycle-Puro回收
            2.5.5.4 胶回收、连接、转化、测序和提取去内毒素质粒
    2.6 实验结果与讨论
        2.6.1 基因片段和载体骨架的电泳结果
        2.6.2 载体检测电泳结果
        2.6.3 质粒构建成功
    2.7 本章小结
第三章 基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性基因编码ROS细胞传感器初步评估
    3.1 引言
    3.2 实验材料与仪器
        3.2.1 实验试剂与材料
        3.2.2 实验仪器与设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 293T细胞的培养方法
        3.3.2 H₂O₂外源刺激瞬时转染实验设计
        3.3.3 Poly-fector试剂瞬时转染实验
        3.3.4 lipo3000转染试剂瞬时转染实验
        3.3.5 H₂O₂外源刺激实验
        3.3.6 Cytation活细胞成像实验
        3.3.7 流式细胞仪统计实验
    3.4 实验结果与讨论
        3.4.1 50 μM H₂O₂处理实验组以及对照组1实验现象和推论
        3.4.2 100 μM H₂O₂处理实验组以及对照组1实验结果和推论
        3.4.3 500μM H₂O₂处理实验组以及对照组1实验现象和推论
        3.4.4 1 mM H₂O₂处理实验组以及对照组1
        3.4.5 对照组2实验现象和推论
        3.4.6 对照组3实验现象和推论
        3.4.7 对照组4实验现象和推论
        3.4.8 流式细胞仪统计结果
    3.5 本章小结
第四章 基于Keap1/Nrf2-ARE通路的内源性基因编码ROS细胞传感器稳转细胞系的构建、筛选和检测
    4.1 引言
    4.2 实验材料和仪器
        4.2.1 实验试剂和材料
        4.2.2 实验仪器与设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 铺293T细胞的细胞培养板
        4.3.2 提取慢病毒包装质粒
        4.3.3 病毒包装
        4.3.4 病毒收集
        4.3.5 病毒浓缩
        4.3.6 病毒侵染
        4.3.7 细胞冻存和复苏
        4.3.8 H₂O₂评估稳转细胞系实验
        4.3.9 紫杉醇(Paclitaxel,Px)药物刺激实验
        4.3.10 白藜芦醇(Resveratrol,RV)药物刺激实验
    4.4 实验结果与讨论
        4.4.1 病毒包装检测
        4.4.2 稳转细胞系获得
            4.4.2.1 内源性基因编码ROS细胞传感器①
            4.2.2.2 内源性基因编码ROS细胞传感器②
        4.4.3 H₂O₂评估稳转细胞系实验检测
            4.4.3.1 活细胞成像实验
            4.4.3.2 ROS细胞传感器①流式细胞仪实验
            4.4.3.3 ROS细胞传感器②流式细胞仪实验
        4.4.4 紫杉醇(Paclitaxel)药物刺激实验
            4.4.4.1 紫杉醇实验浓度确定
            4.4.4.2 细胞传感器①紫杉醇药物刺激实验
            4.4.4.3 细胞传感器②紫杉醇药物刺激实验
        4.4.5 白藜芦醇(Resveratrol,RV)药物刺激实验检测
            4.4.5.1 白藜芦醇实验浓度确定
            4.4.5.2 细胞传感器①白藜芦醇药物刺激实验
            4.4.5.3 细胞传感器②白藜芦醇药物刺激实验
    4.5 本章小结
第五章 基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性ROS细胞传感器在白血病细胞中的应用
    5.1 引言
    5.2 实验材料及仪器
        5.2.1 实验试剂与材料
        5.2.2 实验仪器与设备
    5.3 实验方法
        5.3.1 HL-60细胞瞬时转染实验
        5.3.2 HL-60细胞病毒侵染实验
        5.3.3 H₂O₂刺激实验
    5.4 实验结果与讨论
        5.4.1 500μM H₂O₂外源刺激实验结果
        5.4.2 1.0 mM H₂O₂外源刺激实验结果
    5.5 本章小结
第六章 结论与展望
参考文献
致谢
研究成果及发表的学术论文
作者与导师简介
附件



本文编号：4051686