LAP1/2缺失PRV潜伏转录物相关分子表达特征的研究

发布时间：2025-05-28 04:06

　　伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎、呼吸系统和神经系统障碍为主要症状的一种急性传染病。猪是PRV的天然宿主,也是本病的长期贮存宿主和排毒者。伪狂犬病病毒可以在感染后存活下来的猪中建立潜伏感染。由于受到外界环境变化或者身体受到应激,处于潜伏感染状态的伪狂犬病病毒可以被激活并且释放至环境中,从而感染其他动物,导致伪狂犬病病毒长期存在猪群中,难以根除。PRV在潜伏感染时病毒基因组不复制,也不表达病毒蛋白,仅大量转录病毒潜在相关转录物(Latency-associated transcript,LATs)。目前有关LATs基因在PRV潜伏感染期是如何进行表达的尚不清楚,但是根据已有的报道涉及到两个启动子LAP1和LAP2。因此本研究利用伪狂犬病病毒BAC克隆和galk负筛选技术成功构建了一批有关两个启动子缺失的病毒:包括LAP1/2均缺失的突变病毒JS-US和JS-RS;LAP1/2缺失并加入转录终止序列BGH的突变病毒JS-UBS;LAP1/2缺失并添加绝缘子c HS4和转录终止序列BGH的突变病毒JS-U1CBS和JS...

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 伪狂犬病简介
        1.1.1 病毒的命名
        1.1.2 伪狂犬病的临床特征
        1.1.3 流行病学
    1.2 伪狂犬病病毒的结构特点和基因组特征
        1.2.1 结构特点
        1.2.2 病毒基因组
    1.3 潜伏感染
        1.3.1 PRV的强神经嗜性
        1.3.2 PRV潜伏感染时基因表达情况
        1.3.3 PRV潜伏活性启动子
        1.3.4 潜伏感染模型的研究进展
    1.4 毒力基因UL23(TK基因)
        1.4.1 TK基因的结构
        1.4.2 TK基因对病毒毒力的影响
        1.4.3 TK基因对PRV潜伏感染的影响
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 潜伏活性启动子LAP1/2缺失病毒的构建
    2.1 材料与方法
        2.1.1 细胞、质粒和菌株
        2.1.2 引物设计
        2.1.3 启动子缺失病毒相关转移载体的构建
        2.1.4 负筛选
        2.1.5 突变病毒拯救
        2.1.6 病毒滴度测定
        2.1.7 突变病毒一步生长曲线
        2.1.8 突变病毒的空斑试验
    2.2 结果
        2.2.1 突变病毒JS-US的构建
        2.2.2 突变病毒JS-UBS的构建
        2.2.3 突变病毒JS-U1CBS的构建
        2.2.4 突变病毒JS-U2CBS的构建
        2.2.5 突变病毒JS-RS的构建
        2.2.6 缺失病毒体外生物学特性
    2.3 讨论
第三章 PRV潜伏转录物相关分子表达特征研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 病毒、细胞与实验动物
        3.1.2 引物设计
        3.1.3 提取病毒感染细胞后的总RNA
        3.1.4 DNaseⅠ消化过程
        3.1.5 反转录
        3.1.6 荧光定量RT-q PCR的构建及优化
        3.1.7 LLT和EP0基因在体外培养细胞中的动态表达特征
        3.1.8 拯救病毒EP0间接免疫荧光鉴定
        3.1.9 突变病毒感染体外培养细胞LLT分子的表达特征研究
        3.1.10 突变病毒感染小鼠神经组织中LLT分子的表达特征研究
    3.2 结果
        3.2.1 RT-q PCR的构建及优化
        3.2.2 病毒基因组对RT-q PCR方法的影响
        3.2.3 LLT分子在细胞中的动态表达情况
        3.2.4 IFA
        3.2.5 突变病毒在不同细胞中的LLT分子的表达情况
        3.2.6 小鼠三叉神经组织中LLT分子的表达分析
    3.3 讨论
第四章 TK基因缺失病毒株在大鼠上的致病力分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 病毒
        4.1.2 实验动物
        4.1.3 试剂和设备
        4.1.4 引物设计
        4.1.5 gB基因的扩增
        4.1.6 连接转化
        4.1.7 阳性质粒的筛选和鉴定
        4.1.8 荧光定量PCR标准品的制备以及标准曲线的建立
        4.1.9 荧光定量PCR特异性试验
        4.1.10 大鼠攻毒试验
        4.1.11 提取动物组织中的DNA
        4.1.12 荧光定量检测组织中gB基因的含量
    4.2 结果
        4.2.1 标准质粒的构建
        4.2.2 标准曲线的建立
        4.2.3 SD大鼠滴鼻方式感染JS-2012
        4.2.5 SD大鼠肌肉注射方式感染JS-2012
        4.2.6 SD大鼠滴鼻方式感染JS2012-△TK
        4.2.7 SD大鼠肌肉注射方式感染JS2012-△TK
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历



本文编号：4048050